病原诊断步骤：

一、肉眼检查

（1）肉眼观察患病鱼体有无真菌或寄生虫寄生等。

（2）肉眼观察患病鱼体及器官（包括鳃）的颜色有无变化，有无炎症、充血、出血、贫血、肿胀、溃疡、粘液、腹水等，有无异物附着。

二、显微镜观检

用镊子刮取皮肤、鳍、鳃等外部器官的粘液，或用眼科剪取其一部分患病组织如鳃丝、鳍条等，于载玻片上制成水浸压片，于显微镜下检查有无真菌或寄生虫寄生，必要时拍照记录观察结果。

三、解剖检查

用剪刀从肛门腹部前方剪一个切口，自切口向上沿脊柱下方剪至鳃盖后缘，再沿鳃盖后缘剪至胸鳍前，使内脏器官完全暴露。肉眼观察内脏器官组织的颜色和形状有无变化，如炎症、充血、出血、肿胀、溃疡、萎缩退化、肥大增生、体腔积水等病理变化，有无寄生虫及其包囊等。

四、细菌性病原分离

病料选择：具有典型患病症状的活的、濒临死亡、刚死不久的个体。

取样部位：体表病灶、内脏器官、腹水

分离方法：稀释法、划线法和选择培养基性分离法等。

1、体表病灶分离：先将病灶部位表面用 70% 酒精酒精棉球擦拭消毒或用经酒精灯灼烧的解剖刀烫烧消毒，再用灭菌好的接种环刮取病灶深部组织，接种于普通肉汤培养基增菌或直接在普通琼脂平板上划线分离。

2、鳃部分离：用无菌接种环刮取鳃上的分泌物划平板。

3、内脏器官分离：用 70 ％酒精酒精棉球擦拭，进行体表消毒，无菌打开病鱼的腹腔，以脾、肾、肝等脏器为材料， 先将拟分离病原的部位表面用 70% 酒精棉球擦拭或用经火焰上灼烧后的解剖刀烫烧，以杀死表面的杂菌，随即在烧灼部位刺一小孔，用灭菌的接种环伸向烧灼部小洞中挑取组织后，于平板上划线，分离细菌。

4、腹水分离：用无菌注射器或移液枪，吸取病鱼腹水滴于平板涂布；或用灭菌后的接种环挑取腹水后于平板上划线，分离细菌。

五、划线分离

左手持握琼脂平板，并靠近火焰，右手持取材后的接种环在琼脂平板上分区划线接种。划线时接种环面与平板表面成 30 ～ 40 度的角轻轻接触，在平板表面轻快地移动，接种环不应嵌入培养基内，且不要重复，否则形成菌苔。

一般采用分区划线法进行细菌分离。

六、细菌的分离培养

划线完毕，盖上皿盖，并注明接种材料、日期及操作者等信息。根据不同的样品及不同的培养目的，可选用不同的培养方法。水生动物病原菌一般选择25度-30度培养18-24h 。培养基、温度、时间、湿度。

七、细菌培养纯化

根据菌落大小、颜色、形态、形状、干湿度、透明度、边缘、隆起度等方面的不同，选取典型菌落再次划线，进行纯化。