非洲猪瘟病毒荧光PCR检测试剂盒说明书（兽用）

【兽药名称】  

通用名  非洲猪瘟病毒荧光PCR检测试剂盒

商品名  无

英文名  African Swine Fever Virus Real-time PCR Detection Kit

汉语拼音  Feizhouzhuwenbingdu Yingguang PCR Jianceshijihe

【主要成分与含量】  

【作用与用途】  用于全血、血清、淋巴结、脾脏、肾脏、扁桃体、肺、肌肉、环境样品等样品中非洲猪瘟病毒核酸的检测。

【用法与判定】  

1  用法

1.1  样品采集及处理

1.1.1  活猪样品  无菌采集抗凝血或血清5ml。

1.1.2  病死猪剖检样品或屠宰场剖检样品  无菌采集死猪的脾、肺、肾、扁桃体、淋巴结、肌肉等组织样品。2～8℃低温运至实验室用于检测。

1.1.3  病猪污染的周边环境  采集与病猪相关场所的粪便、饲料、污水样品。2～8℃低温运至实验室用于检测。

1.2  样品处理方法

1.2.1  脾、肺、肾等组织样品处理方法  取适当大小的组织块放入盛有PBS缓冲液的研磨管中，6000r/min震荡研磨45秒，制成约10%的组织匀浆液，5000r/min离心5分钟，取200μl上清液进行核酸提取。

1.2.2  粪便、饲料样品处理方法  取适量的粪便、饲料放入盛有PBS缓冲液的研磨管中，6000r/min震荡研磨45秒，制成约10%的匀浆液，5000r/min离心5分钟，取200μl上清液进行核酸提取。

1.2.3  污水样品处理方法  直接取200μl污水进行核酸提取。

1.3  样品核酸提取  采用DNA提取试剂盒或自动核酸提取仪提取各类样品中的核酸。低温保存待检。

1.4  PCR扩增  将试剂盒置室温使荧光PCR预混液、阴性对照和阳性对照完全溶解，并混匀。取18μl荧光PCR预混液至每个反应管内，然后加2μl所提取的样品核酸，每个反应总体积为20μl。每次检测应设立阳性对照和阴性对照。在荧光PCR仪上进行扩增检测。

1.5  反应程序  

37°C孵育2分钟，95°C预变性5分钟；95°C变性15秒，58°C退火延伸1分钟，45个循环，在每一循环的58°C时收集FAM荧光信号。

2  结果判定

2.1  阳性对照的Ct值应＜30且出现特异性扩增曲线，阴性对照应无Ct值或Ct值≥40且无特异性扩增曲线，试验结果有效；否则应重新进行试验。

2.2  被检样品Ct值＜40且出现特异性扩增曲线，判为阳性；当无Ct值或Ct值≥40，判为阴性。

【注意事项】  

（1）PCR检测的每一步都应在专门区域或地点进行。

（2）使用前应将荧光PCR预混液、阴性对照和阳性对照完全溶化，充分振荡混匀，瞬时离心，尽量吸取液体上层。

（3）试剂盒不同组分间不得交叉，防止污染。

（4）避免反复冻融。

（5）PCR产物均应合理处理，以免造成污染。

（6）严格按照使用说明书进行操作。

（7）按要求贮藏，冷链运输；并在有效期内使用。

【规格】  50次/盒

【贮藏与有效期】  -20℃以下保存，有效期为12个月。

 仅供兽医诊断使用。